乳链菌肽（nisin）的最佳发酵条件曾祥志武汉生物工程学院生物工程系摘要:  通过对本实验室选育所得的乳链菌肽高产菌株的发酵条件进行研究，得出了最佳发酵条件。该菌的最佳碳源为蔗塘.最佳氮源为大豆蛋白脉，二者浓度都为1%.浓度为150 mmol/L以下的Na2HP04 12H20对发酵有促进作用，30℃为最适温度。关键词: 乳链菌肽;乳酸乳酸球菌;发酵条件;效价前言防腐剂是食品中不可缺少的，在食品加工的过程中必然要添加适量的防腐剂。随着社会经济的发展和人们生活水平的提高，人们对食品的安全性的要求越来越高，食品防腐剂的安全卫生条件日益受到人们关注，消费者对添加化学防腐剂的食品心存顾忌。因此，寻求广谱、高效、低毒、天然的食品防腐保鲜剂是目前食品科学研究中的热点之一（刘稳，1996）。Nisin ,又称为乳酸链球菌素,乳酸链球菌肽或尼可素,是由某些乳酸菌( Lacrococcus lactis) 在代谢过程中合成的小分子肽,其成熟分子仅含有 34 个氨基酸残基。研究发现它对大多数革兰阳性菌起抑制作用,如葡萄球菌、链球菌、乳球菌、微球菌、单核细胞增生利斯特菌、分枝杆菌、棒状杆菌等,并能抑制芽胞杆菌属或梭状芽胞杆菌属孢子的形成,但对真菌或革兰阴性菌没有作用。在食品中加入十万到百万分之几( ppm )的乳链菌肽就可抑制引起食物腐败的革兰阳性菌生长和繁殖,并可降低食物加热灭菌所需的温度和缩短加热处理的时间,明显改善和提高食品的质量(包括物理性状和营养价值),延长食品的保存期（胡国平和叶嗣颖，2001）。对 nisin 的毒性和生物学研究，其中包括致癌性、存活性、再生性、血液化学、肾功能、脑功能、应激反应及动物器官病理学等研究，表明 nisin 是安全的（崔建超等，2001）。1969年，FAO/WHO联合食品添加委员会确认 nisin 可作为食品添加剂。目前，nisin 已被50 多个国家和地区广泛使用于食品防腐并表现出良好的应用前景。例如（1）在啤酒工业中 nisin 对于生长和发酵阶段的啤酒酵母活率没有影响，能够有效的抑制啤酒中已发现的几乎所有的革兰氏阳性腐败菌，从而提高啤酒的生物稳定性。（2）在多种蔬菜如番茄、马铃薯、蘑菇、龙须菜、汤料、豌豆等罐头中，使用 nisin 能有效阻止抗热微生物的生长，并能降低热处理的强度，提高罐藏食品的营养价值和保持色泽。（3）在肉品保藏中 nisin 能很好地抑制肉毒校状芽孢杆菌、李斯特菌的生长，同时由于 nisin 加入肉制品中，可降低pH 值，较低pH 值能减少残留的亚硝酸盐，避免对人的危害，保证肉制加工品安全。（4）nisin 已成功地用于干酪、巴氏灭菌干酪、巴氏灭菌奶、罐藏浓缩牛奶、高温灭菌奶、高温处理风味奶、酸奶等，延长货架期，风味保持不变（赵玲艳等，2005）。Nisin 定量分析的最初测定的方法为1934 年Cox GA. 等人建议采用的甲基蓝还原法,后来相继开发了用于 nisin 定量的生物分析方法包括:试管稀释法、浊度分析法、琼脂扩散法、ATP生物发光测定法、绿色荧光蛋白测定法和微量滴定法,其它的还有基于使用阳离子交换色谱、反相高效液相色谱和毛细管区带电泳的分析方法。nisin 定量的生物分析法中最普遍是琼脂扩散法(ADT) ,尤其适用于那些高度不透明的不能用浊度分析法分析的样品,琼脂扩散法的原理是在琼脂表面利用检测菌的生长显示抑菌效果,为消除干扰因素的影响,常使用 nisin 标准液和未知样液在同一平板扩散,并由他们的抑菌圈直径及标准效价换算出效价。由于 nisin 的扩散性能差,故常在检测培养基中加入1 %Tween 以促进 nisin 在琼脂中扩散。目前测定常用的指示菌种为溶壁小球菌、金黄色葡萄球菌和滕黄微球菌,菌悬液的浓度约为107cfu/ ml。生物分析的重要性不可否认,但费时、受低特效性、低灵敏度和源于食品提取液和发酵液相互干扰等因素的制约,借助于免疫方法的迅速、直接和灵敏的技术,现已经开出定量检测 nisin 的免疫技术（李增利，2004）。Nisin的特性:    溶解性    溶液的pH不同、nisin的溶解性也不相同，随着溶液的pH下降，其溶解性上升，而碱性溶液中几乎不溶解，中性水中nisin的溶解量为49mg/ml，但是在0.02M盐酸中溶解量达到118mg/ml。所以，在酸性食品中使用nisin，可以得到理想的效果。    稳定性    nisin在一定的条件下耐热、耐酸稳定性都很强。Nisin的稳定性与溶液的pH值很有关系。Nisin在pH2.5或2.5以下的 稀盐酸溶液中煮沸时，其活性不会发生变化。在冰箱中保存nisin数月之后，其化学和生物学特性及活性不会发生变化，在干燥状态下保存数年之后，仍有活性。    抑菌性nisin能有效抑制引起食品腐败的大多数革兰氏阳性菌,如乳酸杆菌、结核分枝杆菌、明串珠菌等微生物的繁殖生长，特别是对产芽孢的杆菌和细菌孢子萌发有强烈的抑制作用。抑菌作用原理一般认为：nisin是一个疏水、带正电荷的小肽，它对大多数敏感革兰氏阳性细菌表面的吸附作用不一定在专一的作用位置上，而是作用于细胞壁带负电荷的磷壁酸、糖醛酸磷酸脂磷壁酸、磷性多糖或磷脂阳离子成分上。抑制革兰氏阳性腐败菌细胞壁主要组分的合成或细胞膜结合形成管状结构，从而引起细胞膜的渗透，导致小分子量的细胞质，如钾离子、氨基酸等物质迅速流出，引起膜内外能差的消失，立即对DNA、RNA、蛋白质对多糖等物质的生物合成产生抑制作用。Nisin对细胞芽孢的作用主要是抑制其萌芽，并不是杀死芽孢。抑菌作用与菌龄、培养基组成、接种量、加工方法、溶解nisin溶液的pH有关。含有芽孢的食品加热到一定温度，是nisin对含有芽孢的敏感菌抑制作用的必要条件。1.2.2 Nisin 的结构和性质1971 年 Gross 和 Morell 阐明了 Nisin 分子的完整结构(见图 1.1)。Nisin 是由 34个氨基酸组成的多肽，其分子量为 3510，属于羊毛硫抗生素（Lantibiotics），活性部位含有大量的稀有氨基酸，包括羊毛硫氨酸、β－甲基羊毛硫氨酸、脱氢丙氨酸、β－甲基脱氢丙氨酸等一些非编码的氨基酸。一些证据表明，Nisin 的活性分子常以二聚体和四聚体的形式存在，其分子量分别为 7,000 和 14,000. 细菌素的产生受培养基的成分影响很大，一般而言，所选择的培养基必须满足菌体细胞生长的需要，才能保证其产生并释放大量的细菌素。乳酸乳球菌乳酸亚种和其他乳酸菌一样营养要求高，需要复合的培养基才能良好生长。在合成培养基中乳球菌的所有菌株都需要氨基酸类物质，如亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、组氨酸、蛋氨酸、精氨酸和脯氨酸以及维生素如烟酸、泛酸和生物素。不同的乳酸链球菌株，其 Nisin 的效价也有显著的变化，所适应的发酵条件也各有所不同，国内外对这方面的研究较多。本实验室以乳酸乳酸球菌(Lactococcus lactis subsp. Zactis)79UV-S22为出发菌经诱变使该菌在利用M17培酸乳酸球菌(Lactococcus lactis subsp. Zactis)79UV-S22为出发菌经诱变使该菌在利用M17培养基发酵时发酵液效价由原来的1 000 IU/ml左右提高到1 500 IU/ ml左右，高产菌株命名为乳酸乳酸球菌Y-72，本文对该菌的发酵条件做了一些报道。1 材料和方法1.1材料1.1.1菌种1.1.1.1 发酵菌种：乳酸乳酸球菌(Lactococcus lactis subsp. lactis)Y-72，本实验室选育。1.1.1.2 效价检测指示菌：黄色微球菌 由实验室提供1.1.2主要试剂试剂名称            纯度                   生产单位HCL                  AR               开封东大化工有限公司试剂厂乙醇                 AR               天津市东丽区天大化学试剂厂氯化钠               AR               武汉中南化工试剂有限公司吐温-20              CP               国药集团化学试剂有限公司氢氧化钠             AR               广东光华化学厂有限公司Nisin               标准品            Sigma公司大豆蛋白胨         生化试剂          北京双旋微生物培养基制品厂酵母膏             生化试剂          北京双旋微生物培养基制品厂葡萄糖               AR              天津市化学试剂一厂磷酸氢二钠           AR              国药集团化学试剂有限公司琼脂                                 福建省莆田市秀屿区平海琼脂厂1.1.3主要仪器与设备仪器名称                              生产单位JA12002电子天平                      上海精科天平PHS-3C pH计                          上海雷磁仪器厂 RE-52A旋转蒸发器                     上海振捷实验设备有限公司CR21高速冷冻离心机                    日本日立公司ESJ205-4电子分析天平                  沈阳龙腾电子有限公司MK-2485EG微波炉                       海尔电器H200μL微量取样器                     上海仪器厂镀铬游标卡尺                          武汉量具仪器厂 BCD-233冰箱                           伊莱克斯电器SKP-01B电热恒温培养箱                湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司HH-6数显恒温水浴锅                   国华电器公司SFG-02.500电热恒温鼓风干燥箱         湖北省黄石市恒丰医疗器械有限公司FLC-3超净工作台                      哈尔滨市东联公司1.1.4培养基及培养基成分1.1.4.1菌种保藏及传代培养基    M17培养基[[3]固体培养基添加1.5%琼脂。1.1.4.2种子培养基    同上。1.1.4.3发酵培养基    大豆蛋白陈1.0%，牛肉膏0.25%, 酵母膏0 . 25 % , Na2HPO4 ' 12H20  1. 5 % , MgS04 " 7H20  0.012%  pH6.801.1.4.4乳链菌肽效价检测培养基    胰蛋白陈0.8%,酵母膏0.5%,葡萄糖0. 5 % , NaCI 0 . 5 % , Na2HP0, " 12H20  0 . 2 %，琼脂1 .5%，pH6. 80以上培养基在115℃条件下灭菌15分钟。1.2研究方法1.2.1菌体生长测定    用721型分光光度计在600 nm处测定稀释后菌悬液光密度，以同样稀释度的同种培养基作对照。1.2.2  pH值的测定    用pH S-2型酸度计测定。1.2.3效价检测（吴琼等，2003）目前，nisin活性的检测最常用的方法是琼脂扩散法。此方法是抗生素微生物效价测定中最准确，最简便的方法。利用nisin在培养基内的扩散和渗透作用，稀释液加到含有高度敏感检测菌的培养基内，就会形成一定浓度的环形区，而产生透明的抑菌圈，通过测定抑菌圈大小来计算效价、琼脂表面检测菌的生长显示出抑菌效果，为消除干扰因素的影响，常使乳链菌肽标准液与未知样品在同一平板上扩散，并由它们的抑菌圈直径及标准液效价换算出未知液的效价。目前效价计算普遍采用标准曲线法。1.2.3.1样品稀释由于每批次上罐得到的发酵液效价的不同，在实验过程中，不同的样品要稀释不同的倍数。原发酵液、浓缩液、离心后的上清直接从样本中取0.1 ml用0.02mol/l HCL进行稀释；离心后的蛋白质沉淀先用0.02mol/l HCL洗脱定容到10ml，然后按一定的倍数进行稀释。Nisin标样效价单位是1000IU/mg，稀释后用来做标准曲线。用万分之一天平准确称量0.01 g nisin标样用0.02 mol/l HCL 进行稀释，得到10、7.5、5、2.5、1 IU/ml的单位效价的标样溶液。1.2.3.2倒平板先制备指示菌悬液，从试管斜面中取一接种环的黄色微球菌于3ml的蒸馏水中，震荡均匀。将水平台调平，然后将灭菌的检测培养基（200ml）在微波炉中溶化，取出待温度降到约50℃时加入1%的吐温-20(1ml)同时接入指示菌悬液。混合均匀后（尽量减少泡沫）迅速倒入已灭菌的玻璃平板中，置于水平台上使其保持水平冷却，平板的各处均匀不干扰实验结果。1.2.3.3打孔加样倒好的平板可以在冰箱中放适当的时间，使琼脂的弹性比较好，然后取出使温度自然升高到室温，可以进行打孔。用一无菌，直径为5mm的中空打空器在玻璃平板上打孔。打孔时，打孔器与培养基表面垂直，不能把培养基打破，孔间距不得小于20mm，防止抑菌圈交叉。用无菌的牙签或接种环将琼脂柱挑出弃去。根据自己实验样品的多少设计打孔的数目和排列顺序，一般的原则是打孔尽量在中间，而且根据经验将不同稀释倍数的样品交替排列，标准品排在中间。同时一个样品用微量进样器加2孔以上，每个孔一般加入50μl的样品，不能过多溢出。1.2.3.4标准曲线的绘制加样之后的平板在30℃的培养箱里培养20个小时左右，待抑菌圈边缘比较清晰就可以测量。用游标卡尺测量10、7.5、5、2.5、1 IU/ml单位效价的标样溶液在平板上抑菌圈的直径的大小，以效价的对数为横坐标，抑菌圈直径为纵坐标作曲线，因为当乳链菌肽效价在1—10 IU/ml范围时，效价的对数与抑菌圈直径成正比。每一个平板就需要做一条标准曲线，因此不同的实验过程标准曲线并不相同。1.2.3.5计算效价游标卡尺测量样品的抑菌圈的直径大小，由标准曲线得到样品的效价对数值，进一步换算成原始效价。 2 结果与分析  2.1碳源种类对发酵的影响结果与分析2.1碳源种类对发酵的影响    分别以质量浓度1%的不同碳源替代M17培养基中的蔗糖，相同条件下发酵，分别测发酵液的效价、光密度和州值，结果见表1。由表1可见以蔗糖为碳源时发酵液效价和酸度较高，菌体生长也较好。通过对乳酸乳酸球菌的基因分析知道，前乳链菌肽的结构基因和蔗糖发酵基因是紧密连锁的[习。这可能和乳酸乳酸球菌以蔗糖为碳源时乳链菌肽的产量最高的现象有关。2.2碳源浓度对发酵的影响表1碳源种类对发酵的影响    变换M17培养基中蔗糖的浓度，发酵后测发酵液效价和和发酵液光密度(图1)。由图1可见在蔗糖浓度较低时。发酵液效价随着蔗糖浓度的增加上升很快，当蔗糖质量浓度达到1%的时候增加蔗糖浓度对发酵液效价提高不大，而且，过高的蔗糖浓度对发酵有抑制作用，所以选质量浓度1%的蔗糖比较合适。2.3氮源对发酵的影响2.3.1有机氮源对发酵的影响 碳原 效价/(IU"ml-') OD 600 pH蔗糖 1 528 0.84 4.22乳糖 1 410 0.76 4.68葡萄糖 1 290 0.72 4.24麦芽糖 1 300 0.71 4.40果搪 1 020 0.71 4.24糊精 785 0.58 4.68可溶性淀粉   750 0.53  5.40    以M17培养基为基础分别用质量浓度1%的不同氮源替代其中的氮源，同样条件下发酵后测发酵液的效价、pH值和OD值，结果见表2。表2表明大豆蛋白陈为最佳氮源。乳酸乳酸球菌是一类对营养要求较高的菌种，氮源可被利用的难易程度必然影响该菌的初级代谢从而影响乳链菌肽的产。另外，乳链菌肽富含稀有氨基酸，这些稀有氨基酸是从半胱氨酸、丝氨酸和苏氨酸脱水而来，如果氮源中富含这些氨基酸，它们就可以作为稀有氨基酸的前体而促进乳链菌肽的合成.2.3.2无机氮源对发酵的影响    分别以质量浓度0. 5%的(NH4 )2SO4. NH4NO3和尿素等无机氮源替代M17培养基中的氮源，用接种环沾取种子液接时间均未发现有菌体生长现象，说明该菌不能利用无机氮源。时间均未发现有菌体生长现象，说明该菌不能利用无机氮源。时间均未发现有菌体生长现象，说明该菌不能利用无机氮源。于无机氮源培养基中培养。发现无论培养多长时间均未发现有菌体生长现象，说明该菌不能利用无机氮源。2.3.3补加氮源对发酵的影响    以质量浓度1%的蔗糖和大豆蛋白陈替代M17培养基中的碳源和氮源，再补加一定量的其它氮源，同样条件下发酵测发酵液效价，结果见表3。表3显示，补加酵母膏和牛肉膏对乳链菌肽产量有一定的提高作用。2.3.3补加氮源对发酵的影响.    2.4磷源对发酵的影响    以质量浓度1%的蔗糖和大豆蛋白}, 0. 012 % MgS04 " 7H20为基础，添加50 mmol/L的不同磷源进行发酵，测发酵液的效价、pH值和OD值，结果见表4。表4表明，任何一种磷酸盐都能促进菌体生长和乳链菌肽的合成，其中以Na2HP04为最好。磷酸盐的主要作用可能在于它的缓冲能力，它可以阻止发酵液酸度的过分下降，从而有利于菌体生长和乳链菌肽的合成。 以发酵培养基为基础改变其中的磷源浓度进行发酵实验，见图2。结果显示，磷酸盐浓度在50 mmol/ L以下时，磷源浓度对发酵液效价有较明显的影响，磷源浓度约在150 mmol/L时，发酵液效价达到最大值，磷源浓度再升高就会对菌体生长和产乳链菌肽产生一定的抑制作用              2 .6培养温度对发酵的影响    Y-72以发酵培养基在不同的温度下进行发酵，以发酵液OD值不再增加为发酵终了的标志，测发酵液的效价，见图3。由图3可见，约在30℃时发酵液效价和菌体产生量均达最大值，低于此温度发酵速度慢且发酵液效价低，高于此温度，菌体生长量急速下降，发酵液效价也随之下降，原因可能是因为在高温时菌体产酸快从而抑制了菌体生长，乳链菌肽的合成也受到了抑制。温度达到45℃时菌体不能生长。2.7培养方式对发酵的影响    用250 ml的三角瓶分别装不同体积的培养基，分别于30℃进行静止或摇床发酵进行培养。结果如表5所示，不同的培养方式即通风量的大小对发酵无明显影响。2.8接种量对发酵的影响    分别以1%一10%的接种量将种子液接人发酵培养基进行发酵,12h后测发酵液效价，发现接种量对发酵液效价无明显影响，根据以上对Y-72发酵条件的研究，采用以下条件对Y-72进行发酵动力学研究:使用发酵培养基以4%的接种量于30℃下进行静止培养发酵，测发酵液的效价、光密度和pH值。结果如图4所示，该发酵呈明显但以3%一5%时发酵液效价稍高。2 . 9  Y-72发酵动力学研究根据以上对Y-72发酵条件的研究，采用以下条件对Y-72进行发酵动力学研究:使用发酵培养基以4%的接种量于30℃下进行静止培养发酵，测发酵液的效价、光密的度和pH值。结果如图4所示，该发酵呈明显的初级代谢动力学特征，菌体生长量和乳链菌肽产量均在第8h达到最大，8h之后Y-72进入生长稳定期，发酵液效价缓慢下降。参考文献：[1]  叶嗣颖，谢昕，黄庆华，彭颖等．乳链菌肽nisinZ的PH吸附法分离纯化技术研究，同济医科大学学报，2000，29（2）：124-126[2]  邬行言，熊宗贵，胡章助．抗生素生长工艺学，化学工业出版社，1982：429-440[3]  刘志皋. 食品添加剂基础[Ｍ]. 北京:中国轻工业出版社,1994.[4]  刘稳，朱文淼，马桂荣．乳链菌肽的分离纯化和部分生物学性质[J] ．生物化学杂志，1996，12(5)：588-592[5]  李孱，蔡昭铃，丛威，白景华，欧阳藩．温度诱导双水相分离纯化细菌素工艺条件的选取与优化，过程工程学报，2001，10：412-415[6]  朱小乔，刘通讯．极具潜力的天然防腐剂—Nisin [Ｊ]，食品与发酵工业，2003，(2):66-69[7]  李增利．Nisin的生产、提纯和检测，中国食品添加剂，2004，4：64-68[8]  陈秀珠，何松，龙力红等．乳酸乳酸球菌AL2产生的乳链菌肽的提纯和性质[J] ．微生物学报，1996，36(4)：269-275[9]  吴琼. 乳链菌肽效价测定方法的研究[J ]. 食品科学,1999,20 (6) :56-59.[10] 吴琼，生英涛，唐名山，谷体华，葛庆燕。乳酸乳球菌发酵液中乳链菌肽的分离纯化，食品科学，2003，24（9）：103-106[11] 宋莲花，王彦文．乳链菌肽研究进展，食品研究与开发，2004，25（5）：18-21[12] 姜英辉，李光友．乳链菌肽及其应用研究综述，海洋科学，2002，26（4）:32-36[13] 崔建超, 张柏林,郝凌宇等. 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